枯草芽孢杆菌中胞壁肽的分离纯化及其对芽孢的影响（二）

2结果与分析

2.1胞壁肽HPLC分析

肽聚糖是枯草由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、N-乙酰胞壁酸（MurNAc）及肽单元组成的芽孢芽孢聚合体，肽链氨基酸的杆菌组成主要是Ala、Glu、中胞DAP，壁肽还有极少量的分的影Gly，大多数G-及产孢菌具有meso-DAP残基。离纯对枯草芽孢杆菌细胞壁的化及肽聚糖采用变溶菌素酶解，其片段经硼氢化钠还原后，其对采用HPLC进行胞壁肽的枯草分离，得到胞壁肽谱图（图1）。芽孢芽孢从图中可以看出，杆菌枯草芽孢杆菌的中胞胞壁肽主要含有15个胞壁肽组分，主要的壁肽峰8个。肽聚糖经过变溶菌素酶解后，分的影形成以GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP为基本结构单元的二聚体、三聚体、四聚体等。这些胞壁肽组分分子质量越大，保留时间越长，因此，单体目标峰出峰时间较早。Atrih等对枯草芽孢杆菌的胞壁肽进行分析，得到38个组分，在20min保留时间内的前4个组分均为胞壁肽单体，个别组分基团出现酰胺化而保留时间不同。此结果也与文献报道相一致。
 

2.2胞壁肽ESl-MS分析

对每个组分单峰收集，脱盐后进行ESI-MS分析，通过对3号峰的MS分析（图2），其分子离子[M]⁺为m/z869，伴峰：[M+H]⁺为m/z870，该分子质量组成与GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP（理论值：869.9）一致，伴峰的形成是因为在正离子模式下，目的片段会在电离过程中加一个氢，分子质量增加。因此，峰3即为目标物二糖三肽（GM-ＴriDAP），其结构示意图如图2所示。

2.3胞壁肽FTlR

对胞壁肽3号峰单峰收集，冷冻干燥后进行傅里叶变换红外光谱分析，红外光谱图见图3所示，从图中可以看出，在2个区域存在强吸收，一个是～3447cm^-1，另一个是～1020cm^-1。肽链的几个特征带包括酰胺A带（～3500cm^-1）、酰胺Ⅰ带（1600～1700cm^-1）和酰胺Ⅱ带（1510～1580cm^-1）。酰胺A带主要是N-H伸缩振动，对氢键非常敏感；酰胺Ⅰ带是肽链的主要特征带，主要是C=O和C-N的伸缩振动；而酰胺Ⅱ带主要是N-H面内变角振动，以及C-N和C-C的伸缩振动。糖环的特征峰集中在800cm^-1～1200cm^-1之间，包括C-OH的伸缩振动和糖苷键C-O-C的振动叠加吸收信号。峰3的红外光谱的吸收峰归类见表1所示，从表中可以看出，胞壁肽3号峰包涵糖肽的典型基团振动特征，一个是肽链的酰胺吸收带，包括3447cm^-1的酰胺A带、1647cm^-1的酰胺Ⅰ带；另一个是在1200～800cm^-1，1020cm^-1是糖环以及糖苷键的特征吸收峰。因此，胞壁肽3号峰具有典型的糖肽结构特征。
 

2.41HNMR

氢谱是所有核磁共振谱中灵敏度最高的，可以为化合物提供丰富的结构信息。对胞壁肽3号峰的结构进行氢谱分析，检验其是否与GlcNAcMurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP结构相符。氢谱中各官能团的化学特性主要体现在化学位移上，氢原子核外电子云密度越大，化学位移越小，出峰位置越靠近右方。1HNMR谱见图4所示，从图中可以看到典型的胞壁肽信号模式，糖肽官能团本身的性质、取代基等都会对物质的化学位移产生影响，从而改变官能团出峰位置，糖环和肽链表现不同的化学位移。在前人针对肽聚糖片段核磁分析的基础上，对胞壁肽3号峰氢谱的化学位移进行归属，GlcNAc、MurNAc和肽链氨基残基的典型信号介于4.7×10^-6～3.3×10^-6之间，4.67是GlcNAc异头碳原子上的质子共振信号；对于甲基和脂肪烃的亚甲基质子化学位移介于2.5×10^-6～1.1×10^-6之间。综合上述分析，胞壁肽峰3的1HNMR与目标糖肽结构相符。

2.5胞壁肽对芽孢萌发的影响

芽孢萌发后热抗性消失，湿热处理（80℃，20min）不能直接杀灭芽孢，但可将萌发的芽孢杀灭。因此，热抗性消失经常用来表征芽孢是否经历了萌发。为验证本文中得到的胞壁肽是否具有萌发效果，将制备的胞壁肽加入到枯草芽孢杆菌168芽孢液中混合均匀（胞壁肽终质量浓度为1mg/mL），37℃振荡孵育1h。随后，将胞壁肽处理后的芽孢进行湿热处理（80℃，20min），利用平板计数法计算湿热处理前后芽孢数量的变化即为萌发芽孢的数量。胞壁肽对枯草芽孢杆菌168芽孢萌发的影响如图5所示。未加入胞壁肽的处理组中，芽孢数经湿热处理后并未减少，说明芽孢仍保持原有的热抗性，并未发生萌发过程。而加入胞壁肽后的芽孢经湿热处理后数量减少了0.9个对数，说明0.9个对数的芽孢在胞壁肽处理后热抗性消失，发生了萌发，与前人研究结果相一致。由此可知，本试验中制备的胞壁肽（二糖三肽）能诱导芽孢萌发，为后续进一步研究胞壁肽诱导芽孢萌发机理奠定基础。
 

3结论

利用枯草芽孢杆菌为对象，制备、分离纯化细菌营养体细胞壁上的胞壁肽，得到的胞壁肽最小单位为二糖三肽，此胞壁肽可以有效促进芽孢萌发，为芽孢萌发的进一步研究奠定基础。

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